1.  從37℃培養(yǎng)16~20 h 的新鮮平板中挑取一個(gè)單菌落（如大腸桿菌DH52），或1 ml 新鮮的16~20 h過(guò)夜培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)到一個(gè)含有100ml LB培養(yǎng)基的1 L 或500 ml 培養(yǎng)瓶中。于37℃振搖培養(yǎng)約2~3 h（旋轉(zhuǎn)搖床200~300 r/min），每隔20~30 min測(cè)量OD₆₀₀值≈0.4。

2.  在無(wú)菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)，用冰預(yù)冷的50 ml 聚丙烯離心管中，冰上放置10~20 min。

3.  于4℃4000轉(zhuǎn) /分離心10 min，回收細(xì)菌細(xì)胞。

4.  將管倒置1 min，以使后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。

5.  以10 ml 用冰預(yù)冷的0.1 mM CaCl₂重懸每份沉淀，放于冰上 ， 4℃4000轉(zhuǎn) /分離心10 min，回收細(xì)菌細(xì)胞。

6.  每50 ml 初始培養(yǎng)物用2 ml 冰預(yù)冷的0.1 M CaCl₂重懸每份沉定，此時(shí)，可以迅速將細(xì)胞分裝成小份，液氮中冰凍，-70℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

7.  用無(wú)菌吸頭從感受態(tài)細(xì)胞懸液中取200 μl 轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的微量離心管中，加DNA或連接反應(yīng)混合物（體積≤10 μl，DNA≤50 ng），輕旋以混勻內(nèi)容物，冰浴30 min。

8.  將離心管放到預(yù)加溫到42℃的水浴中，90 s。

9.  將混合物快速轉(zhuǎn)移到冰浴中，冷卻1~2分鐘，加入適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基在37 ℃培養(yǎng)45 分鐘，使細(xì)胞復(fù)蘇，并表達(dá)質(zhì)粒所攜帶的轉(zhuǎn)化基因。

10.  將適當(dāng)體積（每個(gè)90 mm平板可達(dá)200 μl）已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到相應(yīng)抗生素的平板培養(yǎng)基上。 

11.  將平板置于室溫至液體被吸收 ，倒置平板于37℃培養(yǎng)箱中，12~16 h，平板培養(yǎng)，克隆在此期間應(yīng)該出現(xiàn)，否則轉(zhuǎn)化不成功。