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載體多克隆位點(diǎn)(MCS)改造步驟
點(diǎn)擊次數(shù):1965 更新時(shí)間:2018-08-17

 

加、減、換一個(gè)載體 的MCS的位點(diǎn) (給一個(gè)表達(dá) 載體加、減、換小表達(dá)標(biāo)簽,如His6, His10,strep II等,和MCS改造是一樣的),其實(shí)技術(shù) 不是問題,問題在于位點(diǎn)的選擇 ,因?yàn)檩d體設(shè)計(jì) 時(shí)應(yīng)該設(shè)計(jì)者也考慮過mcs的問題,應(yīng)該給使用者越多的選擇越好,但為什么有的載體只給有限的幾個(gè)位點(diǎn)呢,一可能是這個(gè)載體其他部位本身含有的限制性切點(diǎn)比較多,因而MCS位置的選擇比較少,二就是設(shè)計(jì)者是自用的載體,沒有考慮到我們的感受 。

 

因此如果你要加、減、換MCS,可以按一下幾個(gè)步驟進(jìn)行:

 

1、找到載體全序列 ,查找有沒有你想要加的位點(diǎn)(Primer premier5……一堆軟件 ,再不濟(jì)了用word),如果沒找到你想加、減、換的位點(diǎn),恭喜了,革命要成功了;

 


2、方法上不太推薦點(diǎn)突變或其他以overlap PCR 為基礎(chǔ)的技術(shù),推薦小片段 克隆 ,也就是做shRNA 載體的那種方法,人工合成(按引物 合成)你想要的MCS序列的正反鏈,兩端加上載體上兩個(gè)切點(diǎn)的粘末端序列,人工退火(95度10min,然后每分鐘降5度直至Tm值下5度,維持10min,即可),不用電泳檢驗(yàn),直接按克隆的連接體系將這個(gè)小片段與你的載體(相應(yīng)酶雙切)連接轉(zhuǎn)化……

 


小片段連入的效率相當(dāng)高,如果大家要檢驗(yàn):在菌長出來后,做PCR檢驗(yàn)(人工合成的這個(gè)小片段的正鏈或反鏈與載體上的引物)。舉個(gè)例子:

 


比如要在某載體的EcoR I和BamH I之間加一個(gè)新的MCS(EcoR V-Kpn I-Xho I-Hind III)(這幾個(gè)位點(diǎn)必須在目的 載體上沒有,如果有這個(gè)切點(diǎn),你又實(shí)在想用的話,可以將目的載體用這個(gè)酶單切,綠豆芽核酸 酶/s1核酸酶平端化,再自連——位點(diǎn)封閉):

 


1、合成 5‘-AATTC GATATC NNN GGTACC NNN CTCGAG NNN AAGCTT G-3'3'-G CTATAG NNN CCATGG NNN GAGCTC NNN TTCGAA CC TA G-5'

EcoR I粘末端  EcoRV      Kpn I                  Xho I               Hind III    BamH I粘末端 ; (這里面有幾個(gè)要點(diǎn),合成時(shí)直接合成粘末端,省得再切,這樣既省合成的錢,效率又高,如果你需要在改造后的載體繼續(xù)使用原載體的連入切點(diǎn),比如上面例子的EcoR I和BamH I,你像例子中一樣可以合成完整的酶切位點(diǎn)粘末端,如果你不想使用它們,那就只合成粘末端,比如上面那個(gè)例子,應(yīng)合成5-AATT GATATC ……和3’-CTATAG ……這樣連接后,EcoR I切點(diǎn)就被封閉了;再有要注意考慮連入位點(diǎn)之間要留一定的間隔,因?yàn)榭恐膬蓚€(gè)酶是很難雙切開的,有時(shí)候分步切都沒用,因?yàn)榱艚o酶結(jié)合的空間太小,沒法結(jié)合l ,一般按照相鄰兩個(gè)酶的推薦保護(hù)堿基數(shù)中較大的數(shù)目留,*?。?/p>

 

2、退火,如上;

3、克隆,同上;

4、檢驗(yàn),同上。測序,收工。

 

突變可以考慮,但如果載體太長了,做點(diǎn)突變越不容易,一方面比較難延伸,另一方面,即使延伸了,其他點(diǎn)突變的幾率也會(huì)比較大,但誰知道呢?有時(shí)候要靠一點(diǎn)運(yùn)氣。如果想突變也是可以。

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